定量聚合酶链反应快速产前诊断21三体

　　国外医学计划生育分册1999年5月第18卷第2期

苏州医学院医学遗传研究室（215007） 刘元华综述 孟平 高锦声审校

　　 摘要 定量聚合酶链反应（PCR）是近年来产前诊断21三体的一种新方法，具有快速、准确等优点。本文就其原理、主要过程作一简要介绍。

　　关键词：定量PCR 产前诊断 21三体

　　 21三体综合征亦称唐氏综合征（down syndrome,DS）是最常见的染色体病之一，新生儿中发病率为1/600～1/800，35岁以上孕妇中发病率更高。其主要临床表现为智力障碍，多伴有心脏、眼、耳等的畸形。在胎儿出生前，可通过绒毛活检或羊膜腔穿刺获取胎儿细胞，经过培养，分析中期染色体来诊断是否为21三体，但此方法所需时间长（至少2～3击），技术要求高。也有通过测定母血甲胎蛋白（AFP）、人绒毛膜促性腺激素（hCG）或游率雌三醇（uE3）等来筛查21三体，但这些筛查方法不是直接诊断21三体，且DS胎儿的检出率只能到达80%左右^[1]。

　　 聚合酶链反应（PCR）方法是一种简便、快速、用途广泛的技术。在PCR扩增的指数扩增后得到的靶序列量与最初的靶序列最是成比例的^[2]。由此，许多作者设计了定量PCR来诊断21三体。DNA模板可以从羊水细胞、绒毛细胞或胎儿血液中提取。根据所扩增DNA序列的不同，这些定量PCR可分为两大类。

　　 一、扩增21号染色体特异的多态性短患联重复序列（small tandem repeats,STR）标记

　　 在基因制图和基因连锁研究中常用的重复序列有三类，即小卫星体或称数目可变的串联重复序列（VNTR）^[3]，（CA）n重复序列^[4，5]及由3～6bp的重复单位构成的短串联重复序列（STR）^[6]。STR最适合作定量PCR分析。一些染色体特异的STRs9只位于某一号染色体），由于串联重复的数目不同而表现出高度多态性，如一STR位点有10～12个等位基因，人群中大部分个体（约90%）将为杂合体，经PCR扩增此STR位点后，将显示两条STR电泳条带（附图）^[7]。 D21S11是位于21号染色体上高度多态性的STR标记，靠近着丝粒，发生重组的可能性很低^[8]。许多作者通过扩增D21S11位点来诊断21三体。引物用荧光标记，凝胶电泳分离PCR产物，最后用自动DNA扫描仪分析。因D21S11是高度多态性的，正常人群中90%以上个体将出现两条荧光标记的STR电泳条带，且它们的荧光强度相同（比值为1∶1），如同时扩增一适当的非多态性的DNA序列来作为内参照（内参照所在染色体应很少发生单体或三体），这两条STR带与内参照的荧光强调比为1∶1∶1。少部分正常样本为纯合子，将出现单条STR带，它与内参照的比为2∶1（附图）^[7]。绝大部分21三体的样本将出现两种情况：①出现三条STR带，荧光强度比为1∶1∶1（表示分别位于三条21号染色体的STR等位基因均相同）。②出现两条STR带，荧光强度比为2∶1（表示三个SRT等位基因中有两个相同，另一个不同）。只有极少数21三体的样本在三条21号染色体的STR标记均相同将只出现一条STR带，它与内参照的比为3∶1（附图）^[7，9，10]。1995年，Gelfi等运用毛细管电泳（CZE）来分离PCR产物，使定量分析更加快速、精确^[11]。如果选用两个或多个21号染色体特异的STR位点，它们同时为纯合子的可能性很小，从而提高了诊断的准确性。Pertl等同时扩增两个21号染色体特异的STR位点D21S11和D211S1414的一对引物分别与D21S11的正负链相同，即扩增同一STR标记。建议选用其它多态性STR标记如D21要413、D211412或D21S1411^[13]。

　　 B 21三体样本比率（a）1∶1∶1 （b）1∶2∶1 （c）3∶1

附图 PCR产物电泳分离，DNA扫描仪分析的示意图（A、B）

　　 二、扩增21号染色体特异的单一序列

　　 1992年，Miller等扩增位于21号染色体上淀粉状蛋白前体基因（AP）的一段长337bp的序列，并同时扩增位于7号染色体上囊性纤维化基因（cs-7）的一段长330bp的序列作为内参照，[35S]-dATP标记PCR产物，正常人AP与CS-7圹增产物的平均比值为1.04，而DS病人为1.69（P＜0.05），这与理论期望值1.0和1.5接近^[14]。Eggeling等用荧光标记的引物分别扩增S100B基因（位于21号染色体21q22.3区域）的一段长216bp的序列和IGF1基因（位于12q23区域）的一段长216bp的序列和IGF1基因（位于12q23区域）的一段长105bp的序列，自动DNA测序仪分析PCR产物。21三体细胞与21双体细胞S100B产物的相对比是1.5∶^[15]。还有作者选用21号染色体上SOD1基因的5号外显子和7号染色体上CFTR基因来检测21三体^[16]。如某些易位型21三体未包括AP或S100B位点，则不能被此两种定量PCR检出。1997年，Lee等设计了一种同源基因定量PCR（HGQ-PCR）来检测21三体。位于21号染色体21q22.3区域的人肝型磷酸果糖激酶基因（PFKL-CH21）与位于1号染色体的人肌型磷酸果糖激酶基因（PFKM-CH1）是一对同源基因，有68%的编码序列同源。作者设计了一对引物同时扩增这两个基因，扩增产物分别长185bp（PFKL-CH21）和365bp(PFKM-CH1)，电泳分离PCR产物再照相，最后DNA扫描仪定量分析。在34例DS（包括2例易位型）和100例正常人PFKM-CH1与PFKL-CH21扩增产物的相对比值分别为1.33±0.323和0.40±0.16，两组间差别有显著意义（P＜0.001）。它所需的模板DNA量很少，且能检测出易位型21三体^[17]。

　　 对于嵌合型21三体，定理PCR可能会出现假阴性，样本中母血的污染也会影响结果的判断。与细胞遗传学方法相比，定量PCR有许多优点：①整个过程可在短时间（大约24h）内完成。②可一次进行大量样本的检测。③样本中所需的细胞数目很少，甚至可以是单个细胞。细胞也可是死细胞。此项技术也适用于检测从植入前胚胎分离的囊胚细胞或从母血中分离的单个胎儿细胞^[18、19]。定量PCR还可检测X、Y、13、18等其它常见的染色体非带倍体，现在许多学者正努力使这些定量PCR方法更加简便、快速、准确。相信在不远的将来，它将成为产前诊断非整倍体的主要手段。

　　参考文献

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　　18 李运星，国外医学计划生育分册，1997；16：4-7

　　19 杨明，国外医学计划生育分册，1998；17：135-139

　　 （收稿日期：1998-09-10）

录入：李夏阁

校对：任媛媛