LPS受体CD14的最新研究进展

第5卷 第2期 解剖科学进展 Vol.5 No.2

1999rh PROGRESS OF ANATOMICAL SCIENCES 1999

刘轩 魏育林

（中国友好医院临床医学研究所中西医结合室 北京100029）

　　摘要 在革兰氏阴性菌引起的炎症反应过程中，脂多糖受体（LPS受体）起着关键作用。它与细菌的类脂A成分结合后可引起细胞活化、细胞因子的释放等一系列连锁反应，这些炎性介质的失控性释放能引起全身炎症反应综合症（SIRS），进而发展为多器官功能障碍综合征（MODS）和多器官功能衰竭（MOF）。本文主要介绍近年来LPS受体及其作用机制的研究进展。

　　在由革兰氏阴性（Gram-negative,G-）菌引起的全身炎症反应综合征（Systemic inflammatory response syndrome,SIRS）过程中，G-菌细胞壁成分脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）通过作用于脂多糖受体（LPS受体）使细胞活化并表达多种蛋白编码基因。这些基因表达产物能引起败血症、组织器官损伤甚至感染性休克和死亡。目前认为，CD14和CD11c/CD18是主要的LPS受体。其中以前者研究得最多、了解得最深入，本文主要论述CD14受体的研究进展。

　　1 分子量与结构

　　人CD14受体^[1]是一种55kDa的糖蛋白，其编码基因位于第五号染色体5q23-5q31区。该基因编码1.5KB的单一转录产物，翻译成蛋白后经加工，添上磷脂酰肌醇基因（phosphatidylinositol，PI）并进行糖基化，最后成为螯和于细胞膜表面的CD14受体。CD14受体蛋白与其它蛋白序列无显著同源性，其主要结构识别特征为N-末端富含亮氨酸的重复单位（repeating leucin-rich motifs/leucine rich repeats）。该种结构在识别LPS中可能起关键作用^[2，3]。而且CD14分子上还存在LPS特异识别位点^[4]。抗CD14的单克隆抗体可识别CD14分子上3到4个不同的表位，其中MY4单抗所识别表位相当保守，常用于研究巨噬细胞与LPS或LBP的相互作用。

　　CD14分子有两种存在形式：一种是位于细胞膜上的膜结合型（membrane-boundform cD14,mCD14），另一种是游离于血清和尿液中可溶性CD14（soluble CD14,sCD14）。 sCD14可能是两种分子量的蛋白混合物，一种为49kDa，较mCD14缺少GPI螯和物；另一种为55kDa，较mCD14只少插在细胞膜上的二酰基甘油组分^[5，6]。而且，sCD14因其细胞来源不同而有不同的羧基端^[1]。sCD14的结构及这些现象发生的原因尚待继续研究。

　　2 分布与表达

　　生理条件下^[6，7]mCD14主要表达于成熟的单核巨噬细胞（MO/Mψ）上，微弱表达于中性粒细胞、肾小球膜细胞、乳房细胞和B细胞。不同组织中MO/Mψ上的cCD14表达水平不同，其中以腹腔巨噬细胞（peritoneal macrophage,PM）高表达，而枯否细胞（kupffer cell,KC）、肺泡巨噬细胞（Alveolar macrophage,AM）和小神经胶质细胞均呈低表达。早期的髓单核细胞和原单核细胞表面不表达CD14。sCD14主要存在于血清中，微量存在于尿液中^[6，8]。其在正常血清中的浓度为2-6μg/ml。

　　急性感染时sCD14含随mCD14表达增加而升高。mCD14既可在内源性蛋白水解酶或磷脂酶的作用下脱落入血成为sCD14，也可由髓样细胞直接分泌入血、尿液中。最近还有关于sCD14髓外合成的报道^[7]。sCD14的生成是否代表了体内的一种生理调节机制尚未搞清。

　　3 功能

　　CD14的主要功能是在脂多糖结合蛋白的协助下结合LPS并引起细胞活化。LPS与CD14是结合的分子比并非1：1，通常它以聚合体形式与CD14结合^[9]。其发生机制推测与CD14上的亮氨酸重复单位有关。mCD14与sCD14受体可通过不同途径与LPS相互作用^[10]，并引起细胞活化（见图1）。表达CD14的MO/Mψ等细胞通过mCD14受体与LPS-LBP复合物结合而被活化。一些不表达CD14的细胞，例如内皮细胞（endothelial cells,ECs）、平滑肌细胞（smooth muscle cells SMCs）、星形胶质细胞，在LPS-sCD14复合物的作用下被活化。这些CD14-的细胞是否也有相应的LPS或LPS-sCD14受体至今尚未证实。

　　图1 LPS与LBP、CD14相互作用引起细胞活化

　　活化的MO/Mψ等CD14+细胞可释放前炎症反应细胞因子、化学因子、生长因子等导致炎症反应，活化的CEs等CD14-细胞可释放白细胞介素（IL）、生长因子、一氧化氮（NO）并表达粘附分子^[11]，参与炎症反应导致组织器官损伤。但MO/Mψ较ECs对LPS的敏感性高；而且两条路径间存在着联系：①MO/Mψ所释放的细胞因子如TNF-α、IL-1可间接活化ECs。②sCD14一方面直接活化ECs，另一方面一定浓度的LPS-sCD14复合物在某种程度上能竞争性抑制LPS与mCD14的结合，从而起到拮抗剂的作用。故sCD14有调节MO/Mψ对LPS反应性的作用。

　　在这两条活化途径中，脂多糖结合蛋白（lipopolysaccharide binding protein,LBP）起了重要作用^[12-14]。LBP为一58-60-kDa糖蛋白，主要在肝脏中合成。生理情况下含量为4-10μg/ml，病理状态下作为急性期反应蛋白浓度升高。在LPS激活细胞过程中，LBP能将LPS迅速传递给CD14而起到提高活化效率的作用。总之，CD14与LBP所构成的LBP/CD14系统能显著提高靶细胞对内毒素的敏感性，在SIRS发病中起关键作用。

　　CD14除作为LPS受体参与细胞活化之外，还有其它功能。如：CD14可非特异性中和、清除LPS从而减轻前炎症反应：结合了LBP的整个细菌甚至可通过与mCD14的结合被细胞吞噬^[15，16]，或者sCD14-LBP-LPS复合物通过与CD14-细胞的某种受体结合而被清除^[17]。CD14也是格兰氏阳性菌细胞壁成分肽聚糖（peptidoglycan,PGN）、分枝杆菌上的脂阿拉伯甘露糖（lipoarabinomannan）及多种病原体的受体^[10]；它可促进单核细胞与活化的上皮细胞粘附；能与活化的淋巴细胞表面的CD14配体相互作用，抑制T细胞增殖和B细胞产生Ig^[1]。

　　4 作用模式

　　CD14对LPS-LBP复合物极敏感，10^-12摩尔LPS在LBP存在条件下就可激活细胞。CD14至少有两个独立的功能结构域：一个是LPS结合区，另一个是介导LPS-CD14与信号传导分子相互作用的区域。前者能18E12封闭后者则不能，鉴于CD14并不具有跨膜区，它是通过GPI螯和物锚定在细胞膜上的，所以当它识别并结合了LPS后，是如何将信号传入胞内的一直是人们关注的焦点。目前认为，MO/Mψ上的CD14受体是一种多蛋白复合物（multi-peotein complex）或称复合受体（multimeric receptor）。它主要由mCD14分子和有信号传导功能的跨膜蛋白分子共同构成（见图2）^[18]。mCD14结合配体，由该跨膜分子将信号传入胞内。尽管至今仍未分离、纯化出这种有信号传导功能的跨膜蛋白分子，但推测其存在的证据是：①CD14-的70Z/3细胞系能被LPS活化^[19]；②CD14表达量很低的MO在无

　　血清情况下，不但能对LPS起反应而且不能被抗-CD14单抗阻断^[20]。这种复合受体中的跨膜分子还被推测为CD14-细胞上的LPS-sCD14受体。但最新研究表明^[21]，抗CD14的特异单克隆抗体biG2和X8能抑制LPS-sCD14对ECs的活化，却不能抑制LPS对MO的活化。所以，这两种分子可能并不完全相同或者只是有某些共同点而已。

　　LPS活化MO/Mψ可导致多种免疫调节蛋白或因子的编码基因活化及表达。NF-kB在该过程中很可能起核心调控作用^[22，23]。NF-kB的活化至少与十种因子的基因表达有关：粒细胞集落刺激因子（G-CSF）、单核细胞集落刺激因子（GM-CSF）、TNF、IL-1、IL-6、IL-2受体α链、MCP-1/JE及NO合成等。这些因子在SIRS中起重要作用。

　　5 调节CD14表达的因素及作用机制

　　CD14在不同组织或部位Mψ上的表达与组织特异的染色质结构（chromatin structure）、甲基化状态（methylations tatus）以及核因子（nuclear factors）密切相关^[6]。此外，CD14的表达还受细胞因子的影响^[24，25]。重组高密度脂蛋白（reconstituted high-density lipoprotein,rHDL）能在G-菌感染时中和LPS并下调MO CD14的表达水平^[26]。

　　应用Western blot和Northern bolt技术证明CD14的表达水平与LPS注射剂量和时间密切相关^[7]。经LPS处理的小鼠（BLAB/c×C57B16），基sCD14在8-16小时达最高水平，各种组织中髓样细胞CD14mRNA也有不同程度的升高。其中以肾和肝升高最显著，其次为肺和心。LPS刺激后24小时组织CD14mRNA回落至正常水平。雄性大白鼠（male wistar rat）肝枯否细胞的CD14表达情况与小鼠相似^[27，28]。此外也有人认为LPS可下调CD14^[29]，估计这与不同的细胞系，尤其是不同的LPS浓度有关。笔者认为，单一地认定LPS，上调或下调CD14可能欠妥。LPS在体内对CD14的调节可能随LPS的浓度、细胞因子等因素影响而有所不同。所以，CD14表达量可能与内毒素血症病情轻重、病程长短有密切关系。但还需体内实验进一步证实。

　　关于CD14表达变化机制研究，目前主要集中在如下两方面：①mCD14从细胞表面脱落（shedding）^[8]。一些生理刺激因素如IFN-γ，抗CD14抗体等均能下调MO mCD14表达水平。表现为mCD14脱落、释放入血清中，脱落的CD14大小与正常人血清的sCD14大小相同。目前认为，mCD14的脱落与单核巨噬细胞膜上的某种蛋白水解酶有关。刺激因素与mCD14结合后的活化信号使这种蛋白酶活性增高，导致CD14被水解、释放；或者mCD14与配体结合后构象改变暴露出切割位点，在酶作用下脱落。②CD14m在转录水平被调节如前所述，LPS可使MψCD14mRNA表达增加。Lauener等人用杂交印迹分析（Northern blot analysis）和核全长转录实验（Nuclear run-off assays）两种方法证实了IL-4显著下调CD14是源于在转录水平上mRNA的下调^[25]。IL-13在调节CD14表达方面有着与IL-4相似的功能及作用机制^[24]。

　　6 临床意义

　　6.1诊断意义 生理情况下，mCD14是MO的一种分化标志，其表达在转录水平上受髓样细胞分化的调节。病理条件下，可以根据身体某部位MO/Mψ上CD14的特异表达异常以及sCD14的浓度异常来对疾病作出诊断。

　　6.1.1感染性疾病 ①败血症（septicemia^[5，30])：在G-菌引起的感染性休克中，高水平的sCD14预示着高死亡率。重度多发性损伤及烧伤患者的sCD14含量于发病后第二周达峰值，持续1周然后逐渐下降，并同时伴有败血症和急性期C-反应蛋白上升。重度感染在临床较多见，早期诊断并阻止感染的进一步发展非常重要。这种sCD14检测有一定诊断价值。②结节病（sarcoidosis）和外源性过敏性肺泡炎（extrinsic allergic alveolitis^[6]）：结节病患者的支气管肺泡灌洗液中AM上CD14表达增加，而且这些CD14强阳性的AM在形态上与血MO更相似。成功的抗炎治疗可使mCD14表达降至对照组水平。外源性过敏性肺泡炎患者不但表现达为AM上mCD14表达增高，而且血清游离sCD14含量也上升。避免接触变应原可降低CD14的表达及含量。

　　6.1.2血液系统疾病 ①白血病（leukemias of myelomonocytic lineage）^[31，32]在急性单核细胞白血病（acute monocytic leukemia ,AMoL）和急性髓单核细胞白血病（acute myelomonocytic leukemia,AMML）中，CD14的检测结果具有重要意义。患者早期髓单核细胞CD14阳性者预后较差，完全康复的机率较低。另有人对236例儿童急性淋巴细胞白血病（acute lymphoblastic leukemia,ALL）患者的髓系抗原进行检测分析，认为髓系抗原（CD33，CD13，CD14）阳性者对化疗的反应性较低，预后不良。②阵发性睡眠性血红蛋白（paroxysmal nocturnal hemoglobinuria,PNH）^[5，33]：患者红细胞表面缺乏一种膜蛋白-C3转化酶衰变加速因子（DAF）。这种疾病与细胞膜上的GPI螯和物形成缺陷有关，病人细胞膜上有包括CD14在内的8种GPI螯和蛋白消失，血清中sCD14分子量全部为55kDa。

　　6.2治疗意义 mCD14既然是MO/Mψ表面的一种抗原，人们自然想到利用抗CD14的单克隆抗体来治疗G-菌感染。已有动物实验报道^[3，4]，用LPS成功地做出灵长类动物猕猴的G-菌感染性休克的动物模型，并证明以单克隆抗体（28C5和18E12）预处理后确实能阻断CD14介导的内毒素反应和休克，避免严重、持续的低血压，显著降低细胞因子的释放。血清中的 sCD14在发生感染时浓度升高，可能有调节MO/Mψ对LPS的反应性、减少其释放细胞因子的作用^[35]。但另一方面它又能导致ECs的活化和损伤，故应在何时、用多大剂量进行sCD14治疗仍需继续探讨。

　　除CD14外，CD11c/CD18也是LPS受体之一^[36]。CD11c/CD18是白细胞整合素（又称β2整合素）家族成员，又称p150/95。它是白细胞特有的糖蛋白，主要存在于中性粒细胞和MO/Mψ上，不表达于正常的淋巴细胞上。也有报道说它还高表达于树突状细胞。CD11c/CD18可与多种配体相互作用，如LPS、ICAM-1。其功能涉及整合素家族所共有的功能，如介导MO、粒细胞与ECs粘附，是纤维蛋白原的受体及结合补体iC3b等。与CD14通过GPI螯和到细胞膜表面不同。CD11c/CD18作为跨膜蛋白能结合LPS并直接引起NF-kB活化，但其LPS结合位点尚不清楚。它引起的信号传导是继CD14后发现的又一条LPS信号传导途径，故有人将之称为LPS第二受体。值得注意的是，CD11c/CD16较CD14对LPS的反应能力弱得多。这是因为血清中有含量丰富的LBP，MO/Mψ上的CD14可作为主要LPS受体迅速引起细胞因子的释放。

　　以上简述了近年关于LPS受体的研究进展，其中主要就CD14受体在分子量与结构、分布与表达、功能、作用模式、调节因素及临床意义几方面的研究情况加以综述。简言之，目前对CD14受体的研究尚存在如下问题悬而未决：①关于作用模型：mCD14作为复合受体，其信号传导分子仍未被分离、纯化出来；sCD14-LPS的受体也仍处于推测阶段，亟待证实。②关于CD14分子结合LPS的特异结合位点及空间构型：该问题正在不断探索和完善。③关于LPS结合CD14后引起胞内信号传导：尽管人们公认NF-kB在LPS引起的细胞活化、细胞因子释放中起到核心调控作用，但具体的信号传导途径和网络还需要继续研究。CD11c/CD18的研究不如CD14广泛而深入。这可能与它在G-菌感染中的地位和作用有关。在临床方面，CD14可能是某些感染性疾病及血液系统疾病的特征性指标之一，sCD14以及针对mCD14的单克隆抗体有望成为治疗G-菌引起的败血症和全身炎症反应综合症的新手段。

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校对：郭莉君 时间：1999年12月1日