慢性粒细胞白血病降钙素基因甲基化的研究

中华血液学杂志 1998年第1期第19卷 研究报告

作者：王顺清　洪文德　彭爱华　罗绍凯　戴木水　戴丽君

单位：510180　广州市第一人民医院(王顺清)；中山医科大学附属第一医院(洪文德、彭爱华、罗绍凯、戴木水、戴丽君)

　　慢性粒细胞白血病(CML)是起源于多能干细胞的肿瘤性疾病，其急变发生的机制不清楚。近来有人报道人类降钙素基因(Calcitonin gene,CT基因)的高度甲基化与不少肿瘤性疾病有关，我们利用限制性内切酶和聚合酶链反应(PCR)技术，检测了不同时期CML患者CT基因甲基化状况，以探索CT基因甲基化与CML疾病分期和进展的关系。

材料和方法

　　1　标本来源　31例CML患者骨髓或外周血，其中慢性期21例，急变期10例。阴性对照10例，其中5例为非恶性疾病患者手术切除的肋骨中的骨髓，另5例为非恶性的贫血患者骨髓；阳性对照为白血病细胞系K562和HL-60。用淋巴细胞分离液分离骨髓或外周血的单个核细胞，PBS洗涤3次。

　　2　DNA提取和定量　用常规的酚/氯仿法抽提上述单个核细胞的大分子量DNA，紫外分光光度计分别测定260nm、280nm和330nm处紫外吸光度A(曾称光密度OD)，计算出DNA浓度及纯度，要求DNA达到酶切所需纯度。

　　3　限制性内切酶消化　酶切体系总体积50μl，底物DNA 1μg，在厂家所提供的条件下加内切酶HpaⅡ10U，37℃水浴16小时。

　　4　引物　参考文献［1］设计跨越第4个CCGG这一甲基化位点(M4)的一对引物，有义链为5′-CCTCTGATCCAAGCCACCTC-3′，反义链为5′-CGCCTGCTGGCACCTCAGTC-3′。因为HpaⅡ能特异性地切断CCGG位点，当CCGG位点发生甲基化变为CCmGG时，HpaⅡ就不能将其切断，所以将细胞基因组DNA进行酶切，如果M4位点已甲基化(CCmGG)，HpaⅡ不能将这一点切断，用上述引物就能扩增出一个566bp的特异性片段；相反，如果M4位点未甲基化而被HpaⅡ切断，则不能扩增出这一特异性片段。

　　5　PCR反应　反应总体积50μl，含10×PCR缓冲液5μl，5mmol/L dNTP 2μl,5μmol/L引物2.5μl，25mmol/L MgCl₂ 3μl，已被HpaⅡ酶切的DNA 100ng

　　(5μl酶切产物)及双蒸水适量，无菌石蜡油50μl。先置95℃变性10分钟，迅速冷却至4℃，加入Taq DNA聚合酶各1.25U，PCR循环条件为：94℃变性，55℃退火，72℃延伸各1分钟，总共35个循环，末次延伸10分钟。

　　6　电泳及观察　取PCR扩增产物15μl于2%琼脂糖凝胶中电泳，EB染色，紫外透射反射仪下观察、照相，用λDNA-EcoRⅠ/HindⅢ作为分子量参照物。

　　7　光密度仪扫描及PCR产物定量分析　照相后负片用光密度仪扫描对PCR产物进行半定量分析。

结　　果

　　如附图所示，两个正常对照和两个阳性对照均分别出现两条带，一条为566bp，另一条为639bp。从附图可看出，正常对照者639bp的条带很明显而CT基因特异性的566bp条带较淡；相反，在两个阳性对照中566bp条带要比639bp条带强得多。我们利用639bp这一非特异性扩增产物作半定量处理，即用TLC扫描仪把所有标本的这两条带进行吸光度检测，计算机分析，并计算出每个标本这两条带的吸光度比值(A₅₆₆/A₆₃₉)，并参考文献［1］报道，将A₅₆₆/A₆₃₉比值≥1者定为阳性，＜1者定为阴性。

　　1，2为正常对照，均阴性；3为HL-60细胞；4为K562细胞；M为标准分子量

附图　K562、HL-60(阳性)及正常对照(阴性)的CT基因的PCR图谱

　　按上述标准，10例阴性对照全部阴性，21例慢性期CML患者中有5例出现阳性，10例急变期CML患者有8例为阳性(结果见附表)。CML的慢性期和急变期CT基因甲基化阳性率有显著性差异。

附表　CML患者CT基因两条带A₅₆₆/A₆₃₉值的比较(±s)

　　注：P₁为与阴性对照组比较；P₂为急变期与慢性期比较　　有两例患者分别检测了慢性期和急变期CT基因甲基化状况，在急变期均呈阳性，其中1例在慢性期即为阳性，两个月后发生急变；另1例慢性期阴性，在9个月后出现急变。另外慢性期阳性的4例患者除1例失访外，其余分别于5，6，14个月发生急性变。

讨　　论

　　我们的研究表明76.2%的慢性期CML患者未发现有CT基因高度甲基化，而在急性变期有80%出现了甲基化，此与文献［2］报道很相似。Nelkin等^［3］还报道加速期(8例中5例)也有明显的CT基因甲基化，这些结果表明CT基因的甲基化与CML的发生关系不大，但与CML的进展、急变密切相关，因此CT基因高度甲基化可以看作是CML进展的一个分子标志。

　　Malinen等^［2］对那些慢性期即检测到有CT基因高度甲基化的CML患者进行追踪观察，发现他们在2到27个月(平均10个月)内发生了急变。我们所观察的4例CT基因甲基化呈阳性的CML慢性期患者，也分别于2～14个月发生了急性变，CT基因甲基化发生在CML急变之前。Malinen等^［2］认为在CML急变之前，可以比临床表现或细胞形态学改变大约提前6个月左右发现CML的进展进入加速期或急变，因此检测CT基因的甲基化可用以监测CML的进展，预测急变的发生，以指导积极的治疗。

　　从我们的实验看到，正常对照和一些慢性期的标本也扩增出较淡的特异性片段，这可能与HpaⅡ不能将DNA彻底消化有关，加上PCR的高度敏感性，即使有很微量和未切断的DNA也能扩增出少量的特异性片段。但经过前述的内对照处理，仍能发现CML慢性期与进展期之间的明显差异，本方法可用以监测CML的进展、预测急变的发生和指导治疗。

参 考 文 献

　　1　Fukuhara T,Hooper WC,Baylin SB,et al.Use of the polymerase chain reaction to detect hypermethylation in the calcitonin gene.A new sensitive approach to monitor tumor cells in acute myelogenous leukemia.Leuk Res,1992,16:1031-1040.

　　2　Malinen T,Palotie A,Pakkala S,et al.Acceleration of chronic myeloid leukemia correlates with calcitonin gene hypermethylation.Blood,1991,77:2435-2440.

　　3　Nelkin BD,Przepiorka D,Burke PJ,et al.Abnormal methylation of the calcitonin gene marks progression of chronic myelogenous leukemia.Blood,1991,77:2431-2434.

(收稿：1996-09-02)

(校对：张志方)