活化的蛋白C拮抗与血栓形成的分子机制

　　国外医学临床生物化学与检验学分册1999年第20卷第6期

　　深圳市人民医院检验科（518020） 徐勇综述

　　重庆医科大学检验系 康格非审校

　　摘要活化的蛋白C拮抗（Acivated Protain C resistance, APC-R）是由于APC无法正常、有效地水解、灭活FⅤa，使得凝血酶原酶复合物、凝血酶生成增加、造成体内高凝状态。目前发现的大部分APC-R是由于遗传性因素引起，即由于FⅤ的单点突变（FⅤR⁵⁰⁶Q）使其对APC的水解产生拮抗而又保留有促凝活性。遗传性APC-R与人体静脉血栓形成有关，但二者相关性因地域、人种不同而有较大差异，其临床表现也因人而异。获得性APC-R逐渐引起重视，但其与临床疾病的相关性及发生机制尚待深入研究。

　　关键词：活化的蛋白C拮抗；血栓形成；基因突变

　　目前对大部分静脉血栓发生的原因尚不十分清楚，但可以肯定与遗传因素有关，因为40％以上的血栓性疾病病人有家族史。然而现已发现的遗传性抗凝因子缺陷发生频率较低，不足以解释遗传性易栓症的发生机理。1993年有了历史性的突破，荷兰的Dahlback等^[1]报道了一种新的遗传易栓症——活化的蛋白C拮抗（Activated protein C Resistance, APC-R），并在1994年由Bertian等证实是由于FⅤ基因单点突破（FⅤR⁵⁰⁶Q，又称FⅤ leiden）所致^[2]，近几年来对这方面的研究逐渐增多并获得了众多新发现。本文将就APC-R发生的分子机制，其与血栓形成的关系及其临床表现作一综述。

　　1 APC与人体抗凝系统

　　1.1 FⅤ、FⅧ与人体血凝系统 人体在生理状态下，血液促凝/抗凝系统保持平衡，但偏向抗凝以使人体血液循环通畅。而在血管损伤部位抗凝系统下调，促凝系统占优势以利于止血。产生于血管损伤部位的凝血酶可使FⅤ、FⅧ激活，同时使血小板聚集活化；并使纤维蛋白原转变为不溶性的纤维蛋白网络。FⅤa、FⅦa结合于激活的血小板表面暴露的带负电的磷脂并作为FⅨa、FⅩa的受体位点。FⅨa和FⅩa是蛋白水解酶，由FⅦa-TF复合物水解相应的酶原而产生。FⅨa和FⅩa之间的膜结合物有效地激活FⅩ，从而构成“Ⅹ复合酶”（Ⅹ ase complex或tenase）复合物。类似地，FⅤa和FⅤa形成“凝血酶原酶（Prothrombinase）”复合物，从而产生凝血酶。人体的凝血反应是一个高效的酶促反应过程，失控的促凝反应将变成对人体的威胁。为了对付这一个潜在的威胁，人体内凝血酶可作为一个天然抗凝系统——蛋白C（ProteinC pC）系统的启动因素，此时凝血酶从一个促凝因素变成一个依赖于内皮细胞的抗凝因素：在完整血管处产生的凝血酶结合于内皮膜蛋白——TM而激活蛋白C，TM是内皮细胞上凝血酶的受体，是凝血酶的强力调节剂和激活PC的辅助因子；活化的蛋白C（APC）通过有限的蛋白水解而灭活膜结合的FⅤa和FⅧa，这个反应可被蛋白S（PS）及未激活的FⅤ加强。

　　1.2 PC、PS与FⅤa灭活 PC为维生素K依赖性蛋白，与FⅦ、FⅨ及FⅩ有同源性，有共同的调节组成：（从N端开始）一个维生素K依赖性γ-羧基谷氨酸（Cla）富有区；两个EGF样片段；一个丝氨酸蛋白酶（SP）调节子。血浆中大多数PC以双链形式存在，其轻链含Gla和EGF片段，重链含SP调节子。在凝血酶-TM复合物激活下，一个12aa的激活肽从重链N端释放，SP调节子转变成为一种活性酶，形成APC；APC高度特异地水解切割FⅤ及FⅦa上有限数目的肽键，但APC只特异地切割灭活膜结合型FⅤ和FⅧa，而对于循环中的FⅤ和FⅧa几乎无影响。未激活的FⅤ与具同源性的FⅧ有共同的调节子排列：A1，A2，B，A3，C1，C2。凝血酶或FⅩa激活FⅤ后，切割三个肽键：Arg709(A2-B)；Arg108(B)；Arg1545(B-A3)。活化的FⅣa由重链（A1＋A2）和轻链（A3＋C1＋C2）组成，由Ca²⁺依赖性肽链结合在一起。FⅧ的激活稍有不同：切割发生在A1－A2，A2－B，B。APC对二者的切割均在A1－A2内，FⅤa为Arg306，Arg506，Arg679；FⅧa为Arg336，Arg562。APC切割后，FⅤa和FⅧa失去抗凝活性。

　　aPC单独抗凝活性极低，只有在蛋白S（PS）和FⅤ的辅助下其抗凝活性才可有效表达。目前，未激活的FⅤ作为APC辅助因子的作用机理尚不清楚^[5]。

　　pS也是维生素K依赖性血浆蛋白，与其它维生素依赖性促凝因子不同的是，它不是一个丝氨酸蛋白酶。PS作为APC辅助因子的机制尚不完全清楚，有人提出PS提出通过促进APC与磷脂表面的结合以及清除针对APC水解FⅤa、FⅧa的FⅤa、FⅨa依赖性的保护作用而发挥作用。最近有人提出PS的辅助作用是发生于FⅤa上的Arg306切割而不是Arg506切割，加之FⅤa对Arg506的保护作用，提示Arg306是凝血酶原复合物中调节FⅤa活性的关键位点。现认为FⅤa在Arg506的迅速水解切割有助于Arg306的缓慢水解，Arg306的切割使得FⅤa活性彻底丧失^[3]。也有报道PS通过直接作用于FⅤa、FⅩa及磷脂表面而直接抑制凝血酶原酶的激活，从而发挥非APC依赖性的抗凝活性。

　　pC、PS的杂合子缺陷与静脉血栓发生有相关性；2％～5％的血栓病与之有关。人群中的PC缺乏发生频率约为1/300，血栓患者中PC缺陷发生频率升高10倍。PS缺陷在人群中的发生频率仍未知，但家族研究提示PS缺陷相关的静脉血栓形成与PC缺陷相似。PC、PS纯合子缺陷常在新生儿时即表现为严重的、致死性的血栓形成，显示PC系统在调节血液凝固中的作用。

　　2 FⅤ突变与APC拮抗的产生

　　fⅤ：Q⁵⁰⁶突变使APC三个切割位点之一的Arg506丢失，Arg506的Km较Arg306低10倍，二者的Vmax相似，使得二位点的切割依赖于FⅤa的浓度。正常的FⅤa浓度下，Arg506的切割比Arg30快10倍，FⅤa：Q⁵⁰⁶的活性被抑制的速度比FⅤa：R⁵⁰⁶低10倍，使产生的FⅤa维持更长的时间并与FⅩa形成凝血酶原活性复合物，从而导致凝血酶生成增加和高凝状态。Arg506突变不影响FⅤ转变为FⅤa，故患者的促凝活性是正常的。

　　很早就知道FⅩa保护FⅤ a免受APC的降解，现在发现这是由于选择性保护Arg506位点；此外有报道PS作为APC辅助因子是由于作用于Arg306位点切割而不是Arg506。故APC介导的游离FⅤ a降解与凝血酶原酶复合物中的FⅤ a降解是通过不同的途径；为抑制凝血酶原酶复合物中的FⅤ a，Arg306切割较Arg506更重要，故当FⅩa或TF途径启动凝血反应时FⅤ a：Q⁵⁰⁶与FⅤ a：R⁵⁰⁶的抑制速度几乎相同。这也可以解释遗传性APC-R表现型较温和。

　　据国外资料报道，95％左右的APC抗性是由FⅤ的单点突变（FⅤ： q⁵⁰⁶）所致^[2]，未带有FⅤ： q⁵⁰⁶等位基因的血栓病人偶尔也发生APC-R，提示APC-R也可能由其它未证实的机制引起；1998年分别在香港和英国剑发现了两种Arg306突变Arg306→Gly和Arg306→Thr^[4,5]，这一方面证实了Arg³⁰⁶APC一切割位点在调节凝血酶原酶复合物中的重要作用，同时也提示可能有多种基因突变影响FⅤ的关键位点而导致APC-R。上述两个位点的突变与APC-R发生率及静脉血栓形成的关系，尚需在世界范围内进一步研究。目前的研究显示FⅤ突变在欧洲的白种人中发生率较高，而在亚、非、澳、美洲的原居民中较少发现，有明显的种族差异。我国近年有少数几例FⅤ突变的报道^[6]，但缺乏一般情况介绍和家族调查数据。香港发现的Arg306→Gly突变，可能值得在中国人中进行新的调查研究。

　　西方国家FⅤ： q⁵⁰⁶的发生频率很不平衡；南瑞典地区血栓病高发区的FⅤ突变率高达15％；其他欧洲国家也有较高的发生率。如德国、希腊等国可高达10％；在荷兰、英国和美国则为3％～5％；而在意大利、西班牙则较低，为2％左右；中东地区的阿拉伯人和犹太人也可见FⅤ变异。甚至在同一国家内也有很大的变异，如在法国Lille地区为1％，而在Straburg为10％^[7]。

　　3 遗传性APC拮抗与静脉血栓形成

　　遗传性因素在血栓形成病理中很重要，现已观察到在40％的血栓病人中有家族史，但促使血栓发生的遗传性因素仍未完全澄清，在大多数的血栓病人中，只有10％的静脉血栓病人带遗传性的抗凝因子（如AT、PC、PS）缺陷。APC-R的发现使遗传性易栓症的机理研究迈进了一大步，目前已出现了一大批APC-R与静脉血栓危险因素增高的报道，但由于所选择的病人标准和人种的差异，所报告的数据有一定的差异。如Bertina等人报告荷兰门诊血栓病人遗传性APC-R的发生率约为20％左右^[2]；在南瑞典却为28％^[8]，那里是FⅤ突变的高发区；Ridker等人的一项对健康男性长达8.6年的调查中发现，发生血栓病的组别中，FⅤ： q⁵⁰⁶的发生率只有11.6％^[9]。但总的来看，由于FⅤ突变所引发的APC-R的确是血栓发生的重要高危因素，现已公认由FⅤ突变引发的遗传性APC-R是目前所见的静脉血栓形成最常见的遗传诱因，其杂合子患者血栓发生率较其它人高6～8倍，而纯合子的发生率则高30～140倍^[2]。

　　遗传性APC-R的临床表现与其它抗凝因子（PC、PS、AT）的缺乏相似，深静脉血栓（DVT）是最常见的，而肺栓塞较少见。其临床血栓发病率的个体差异较大，有些人可能终身不发生血栓，而有些人则从小反复发生严重的血栓，纯合子发病机率高于杂合子；发生血栓的危险性终生存在，并随年龄的增长而增加，但有25％的患者在50岁以前发生血栓。此外，遗传性APC-R个体发生血栓也与环境因素有关，包括口服避孕药、创伤、外科手术及妊娠，甚至有报道长时间旅行静坐也可能诱发APC-R个体发生血栓。在一项对50个APC-R家族的研究中发现，首次发生血栓并与环境诱因相关的占病人的63％^[10]。妇女口服避孕药及妊娠是诱发血栓形成的高危因素，因为在口服避孕药或妊娠期间发生血栓或血栓并发症的妇女中，分别发现有30％和47％～60％的病人有APC-R；遗传性APC-R与流产的关系近来有所报道并认为APC-R是导致流产的一个重要因素，但现有的报道仍有矛盾之处：Dizord等研究的一组复发流产妇女中尽管有APC-R，但却无FⅤ突变^[11]；而Brenner等的病例资料中却发现FⅤ突变率很高^[12]。APC-R可能是术后血栓形成的主要病理因素之一，有报道膝关节成形术后发生DVT的病人中有30％发现有APC-R。遗传性APC-R若再合并有其它抗凝因子的缺陷（如PC），则发生血栓的机率将显著增加^[19]。

　　遗传性APC-R与动脉血栓发生的关系似乎不大，有报道FⅤ： q⁵⁰⁶纯合子的年轻患者有心肌梗塞发生，但这方面的研究还需进一步深入以阐明二者的关系^[13]。

　　4 获得性APC-R

　　在家族研究中发现，有些APC-R家族患者并无FⅤ突变，提示APC-R的遗传学基础不一定仅为FⅤ突变，亦有获得性APC-R的可能。国内王鸿利等人报道的一组数据显示，中国DVT患者的APC-R阳性率明显高于正常人，但却未发现有FⅤ突变。有研究提示，中风患者APC比率明显低于正常人而并无FⅤ突变^[13]；Visser等最新的研究表明，非FⅤ突变所致APC-R也是静脉血栓发生的高危因素。狼疮性抗凝物质（LA）由于可干扰PC系统反应而被认为可能导致获得性APC-R^[14]。Ehrenforth等人报告在300例易栓症患者中45（15％）例发现有APC-R，其中17例（37.7％）LA阳性获得性APC-R也发现于急性血栓形成患者，这可能与急性时相反应中促凝因子如FⅤ和纤维蛋白升高以及具有APC抑制性的α_1-抗胰蛋白酶升高有关^[7]。妊娠中由于生理性适应而使促凝系统效率增高、PC系统受到抑制，APC反应低于未妊娠妇女，若合并其它病理性抗凝物质，也有可能发生获得性APC-R。这方面的研究尚待深入。

　　参考文献

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　　4 Chan WP, Lee CK, Kwong YL, et al. Blood, 1998；91:1135-1139

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　　9 Zoller B, Svensson PJ, He x, et al. J Clin Invest, 1994；94:2521

　　10 Dizon Tl. J Reprod immunol, 1997；34:217

　　11 Brenner Bl. Br J haematol, 1997；97:551

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　　13 Fisher M, et al. Stroke1996；27:1163

　　14 Visser MC, Fernandez JA, amersco SF, et al. Br J Haematol, 1998；12:146

　　(1998-11-22收稿 1990-02-05修回)

录入：姬颖

校对：惠冬莉