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钒酸钠改善严重烫伤大鼠肌细胞胰岛素受体TPK活性的研究
第三军医大学学报1999年第21卷第1期
陈彬 许霖水 吴喜贵
提 要：目的：探讨钒酸钠改善创伤后胰岛素抵抗和糖代谢紊乱的机制。方法：用钒酸钠胃饲30%TBSAⅢ度烫伤大鼠，观察血糖、胰岛素、肌细胞膜胰岛素受体结合特性和胰岛素受体酪氨酸蛋白激酶(IR-TPK)活性的改变。结果：钒酸钠降低严重烫伤大鼠空腹血糖水平，不改变胰岛素水平，也不改变肌细胞膜胰岛素受体最大结合率和结合容量，但可显著增加胰岛素刺激的IR-TPK活性。结论：钒酸钠可不通过胰岛素受体介导而直接刺激IR-TPK活性，改善靶组织对胰岛素的敏感性。
关键词：烧伤 钒酸钠 胰岛素受体 酪氨酸蛋白激酶
钒酸钠具有广泛的类胰岛素作用，能稳定地控制血糖而不增加血浆胰岛素水平。在胰岛素依赖性糖尿病和非胰岛素依赖性糖尿病动物模型中发现钒酸钠能有效地缓解胰岛抵抗。本研究以30%体表面积背部皮肤全层烫伤(30%TBSA)大鼠为模型，观察钒酸钠对严重烫伤大鼠糖代谢和肌肉胰岛素受体结合特性、受体酪氨酸蛋白激酶(Tyrosine protein kinase,TPK)活性的影响，旨在了解其对创伤后胰岛素的改善效果及作用机理。
1 材料与方法
1.1 主要试剂
CNBr-Sepharose 4B (Pharmacia)，WGA(第二军医大学，上海)，N-乙酰氨基葡萄糖(Aldrich),［r-32P］ATP(福瑞公司，北京)，HistoneⅡB(Sigma)，正钒酸盐(北京化工厂)，125Ⅰ-胰岛素及RIA试剂盒(华西糖尿病研究所)，血糖试剂盒(保定长城临床检验试剂公司)，其余试剂均为AR级。
1.2 方法
1.2.1实验动物Wistar雄性大鼠，体重(200±20)g，本校实验动物中心提供。按本室建立的方法［1］制作30%TBSAⅢ度烫伤模型。对照组除不烫伤外，其余同烫伤组。上述大鼠随机分成4组：烫伤组(D)，烫伤灌药组(DV)，正常对照组(C)，正常灌药组(CV)，每组动物7只。灌药组按每日20 mg/kg体重胃饲0.4%正钒酸钠盐生理盐水稀释液，连续3 d，对照组给予等剂量的生理盐水。
1.2.2 标本收集动物第3天禁食过夜，麻醉后尾静脉取血，肝素抗凝分离血浆，-30℃保存，用于空腹血糖及胰岛素测定。此后断头处死大鼠，从后肢取出肌肉组织制备和纯化胰岛素受体。
1.2.3 空腹血糖及胰岛素测定血糖测定用葡萄糖氧化酶法，胰岛素测定用放射免疫分析法，按说明书操作。
1.2.4 胰岛素受体增溶及纯化WGA-Sepharose 4B亲和层析柱(1×5 cm)按文献［2］制作，肌肉细胞膜胰岛素受体增溶及纯化参考Madhur等［3］方法，蛋白质定量用Lowry法。
1.2.5 肌细胞胰岛素受体测定按文献［1］的方法。
1.2.6 胰岛素受体TPK活性测定参考Grunberger［4］的方法并加以修改。TPK活性以每mg蛋白每分钟HistoneⅡB转移的32P fmol数扣除空白管(未加外源底物)fmol数的差值表示，胰岛素刺激的受体TPK活性以胰岛素刺激值减去基础值的fmol*mg－1*min-1表示。
1.2.7 统计分析胰岛素受体结合分析按双位点受体计算机软件程序处理，其它数据选用第三军医大学数学教研室编制的《医用统计程序包SPMR》相应程序处理，结果以X±s表示。
2 结果
2.1 钒酸钠对空腹血糖水平的影响
大鼠严重烫伤3d后其血糖与正常对照组比较升高44.4%(P＜0.01)，经钒酸钠胃饲3 d后，CV组与C组相比，变化不显著；DV组与D组相比，血糖明显降低，接近正常对照水平。表明钒酸钠对严重烫伤大鼠高血糖有明显改善作用。
2.2 钒酸钠对空腹血浆胰岛素的影响
严重烫伤后大鼠血浆胰岛素显著升高，钒酸钠胃饲后，CV组与C组相比血浆胰岛素水平降低，DV组与D组相比改变不显著，见表1。
2.3 钒酸纳对肌肉细胞膜胰岛受体结合特性的影响
4组大鼠肌细胞膜胰岛素受体最大结合率差别均不显著。严重烫伤后受体最大结合容量较正常对照显著降低。钒酸钠灌服后，CV组与C组，DV组与D组相比，差异均不显著。见表1。
表1 钒酸钠对大鼠血糖、胰岛素及肌细胞胰岛素受体的影响(X±s)
tab 1 Effect of vanadate on plasma glucose, insulin level and insulin receptor
on the cell membrane of skeletal muscle in rats (X±s)
| Group |
|
Insulin receptor |
| n |
Glucose |
Insulin |
|
| |
|
(CB/mmol*L－1) |
(mu/L) |
Maxium binding rate |
Maxium binding capacity |
| Control |
|
|
| Untreated(C) |
7 |
5.77±0.74 |
17.01±3.95 |
13.84±0.86 |
1.19±0.50 |
| Vanadate treated(CV) |
7 |
5.09±0.86 |
9.24±4.53▲ |
13.50±0.65 |
1.14±0.12 |
|
Scalded |
|
|
| Untreated(D) |
7 |
8.33±1.86▲ |
29.66±7.76▲ |
12.40±1.79 |
0.60±0.06 |
| Vanadate treated(DV) |
7 |
5.47±1.20△ |
27.96±5.02 |
12.86±0.69 |
0.58±0.10 |
▲：P＜0.01 vs C；△：P＜0.01 vs D
2.4 钒酸钠对大鼠肌细胞膜胰岛素受体TPK活性的影响
在基础状态下，除D组TPK活性略降低外，其余三组大鼠TPK活性均无显著差异。在10-7mol/L胰岛素刺激下，D组TPK活性比C组显著降低，经钒酸钠胃饲后，CV组与C组相比，其TPK活性无显著变化；DV组TPK活性明显升高，接近正常对照水平。当用胰岛素刺激的32P掺入量减去基础32P掺入量的值表示IR-TPK活性时，结果显示烫伤后肌肉胰岛素刺激的IR-TPK活性显著降低，钒酸钠胃饲不改变正常大鼠胰岛素刺激的IR-TPK活性，但可恢复烫伤大鼠胰岛素刺激的IR-TPK活性，见表2。
表2 钒酸钠对骨骼肌细胞胰岛素受体TPK活性的影响
tab 2 Effect of vanadate on the activity of skeletal muscle-derived insulin receptor TPK
| Group |
n |
Basic |
Insulin stimulation
(10-7mol/L) |
△TPK |
|
Control |
|
| Untreated(C) |
16 |
1.43±0.26 |
2.36±0.25 |
0.95±0.17 |
| Vanadate treated(CV) |
16 |
1.38±0.30 |
2.38±0.21 |
1.00±0.21 |
|
Scalded |
|
| Untreated(D) |
16 |
1.25±0.12 |
1.60±0.23* |
0.35±0.17* |
| Vanadate treated(DV) |
16 |
1.41±0.28 |
2.18±0.48△ |
0.77±0.32△ |
unit:fmol32P*mg－1*min-1;*:P＜0.01 vs C；△：P＜0.01 vs D
3 讨论
钒酸钠具有类胰岛素样作用，能迅速而持久地降低血糖。给链脲佐菌素(Streptozotocine,STZ)糖尿病大鼠胃饲钒酸钠2～3 d可使大鼠升高的血糖降至正常［7］。本实验结果显示：严重烫伤大鼠胃饲钒酸钠3 d，可使血糖恢复正常，而对血浆胰岛素水平无明显影响，与文献［5，6］相一致。表明钒酸钠降血糖作用与磺脲类药物不同，它不改变大鼠血浆胰岛素水平，而发挥广泛改善胰岛素抵抗的作用。一般认为钒酸钠可通过改变糖代谢一些关键酶活性，如增加外周组织对胰岛素的敏感性，而使血糖恢复［8］。有人认为钒酸钠降血糖的机制是通过对靶组织胰岛素受体途径来实现的［9］。本结果显示，钒酸钠不改变大鼠肌细胞胰岛素受体活性，而是直接激活受体TPK活性，这与Challiss和Venkatesan等［10，11］的研究结果相一致。表明钒酸钠降血糖效应的发挥可以不通过肌肉组织胰岛素受体水平，而直接涉及受体TPK信号耦联传递环节。提示钒酸钠可能通过不同作用方式改善糖代谢和胰岛素抵抗，其中包括增加骨骼肌对葡萄糖的摄取；增加糖原合成酶对血糖敏感性，增加糖原合成；提高组织对胰岛素的敏感性，促进糖的氧化作用。本资料表明，TPK活性的降低与烫伤大鼠血糖升高密切相关(r=0.9169,P＜0.01)，而钒酸钠胃饲后，肌细胞膜TPK活性的恢复与大鼠血糖的降低也显著相关(r=0.9632,P＜0.01)。进一步说明，钒酸钠提高胰岛素受体TPK受体信号耦联途径是改善烫伤后糖代谢紊乱和胰岛素抵抗的关键步骤。
作者简介：陈彬，男，30岁，讲师，硕士
作者单位： 第三军医大学基础医学部生物化学教研室 重庆，400038
参考文献
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［9］ Tamura S, Brown T A, Whipple J H， et al. A novel mechanism for the insulin like effect of vanadate on glycogen synthesis in rats adipocytes. J Biol chem,1984，259(10):6650
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