血小板源生长因子-AB对成纤维细胞周期及DNA合成的影响

　　第四军医大学学报1999年第20卷第11期

董茂龙　陈璧　贾赤宇　汤朝武　曹云新

　　摘　要：目的:探讨血小板源生长因子(PDGF)-AB在创面愈合及瘢痕增生过程中的作用机制；方法:取第3代～6代体外培养的人正常皮肤成纤维细胞(NsFb)及增生性瘢痕成纤维细胞(HTsFb)，经PDGF-AB作用后，用³H-TdR参入法测定DNA合成的变化，用流式细胞术测定细胞周期的变化.结果：PDGF-AB作用后，两种细胞DNA合成均明显增加，S期细胞数百分比均明显增高，G₁期细胞不断进入S期，但作用有差异.结论:PDGF-AB能加快细胞分裂增殖，加速创面愈合，在瘢痕增生中可能起重要作用.

　　关键词：血小板源生长因子　流式细胞数术　细胞培养　³H-TdR 参入

　　引言

　　血小板源生生长因子（platelet-derived growthfactor,PDGF)是创面愈合过程中较早出现的生长因子之一，在创面愈合的全过程中均起重要作用^［1］. PDGF是由A,B两条单链结合构成的二聚体结构，有PDGF-AA,AB,BB三种形式^［2］. 我们用³H-TdR及流式细胞术观察了PDGF-AB对成纤维细胞细胞周期与DNA合成的影响，探讨PDGF-AB促进伤口愈合作用的机制及其在瘢痕增生中的作用.

　　1　材料和方法

　　1.1　试剂　　PDGF-AB购于深圳晶美生物公司. 原液浓度为10 g/L,实验时用DMEM配成所需浓度. DMEM培养基为美国Gibco公司生产，胰酶为Dibco公司产品，新生小牛血清为上海产.

　　1.2　成纤维细胞培养　将手术中剩下的人正常皮肤及增生性瘢痕，2.5 g/L洗必泰溶液浸泡5min消毒，生理盐水漂洗3次，剪成约1 mm×1 mm×1 mm大小的组织块，接种于含有100 mL/L小牛血清(FCS) DMEM的培养瓶中，置于37.0℃,50 mL/L CO₂孵箱中培养，3 d换液1次，约4 d～6 d成纤维细胞长出组织块，1 mo左右长满瓶底，用1.25 g/L胰酶+0.1 g/L EDTA消化传代，第3代～6代细胞用于实验.

　　1.3　³H-TdR参入实验　取第3代～6代对数生长期的NsFb和HTsFb，T/E消化，1500 r/min离心10min，用含100 mL/L FCS的DMEM配制成浓度为2.5×10⁷/L的细胞悬液，接种于96孔板200 μL/孔，置于37.0℃,50 mL/L CO₂孵箱中培养12 h，待细胞贴壁后，吸出原培养液，加入含有不同浓度PDGF-AB+20 mL/L FCS的DMEM，NsFb和HTsFb分别设置PDGF-AB 0，1.25,12.5,25,50,100 μg/L 6个浓度组，继续培养36 h，每孔加入18.5 kBq(共20 μL)的³H-TdR，每一次浓度设置3个复孔，每一浓度重复3次，继续培养12 h吸去培养基，胰酶消化细胞，用ZT-Ⅲ型多孔细胞样品收集器收集细胞于999型纤维膜上，红外线烤干加闪烁液，于Beckman LS-6500液闪计数仪上计数.

　　1.4　流式细胞术测定细胞周期　取第3代～6代处于对数生长期细胞，常规消化、离心、计数，调整细胞浓度为1×10⁵/L，按3×10⁵/25 mL培养瓶接种于培养瓶，置于孵箱培养12 h，待细胞贴壁后，换成含PDGF-AB +20 mL/L小牛血清的DMEM继续培养48 h，设置PDGF-AB 0,12.5,50μg/L 3个浓度组. 将培养的细胞，常规消化、离心，PBS洗涤2次，加入700 mL/L乙醇固定，离心收集细胞，经PBS洗涤后，加入PI 300μL染色30 min，350目筛网过滤，去除成团细胞，ELITE-ESP型流式细胞仪上测定细胞周期及DNA含量.

　　统计学分析:采用第四军医大学统计学教研室开发的SPLM医用统计软件包进行方差分析.

　　2　结果

　　2.1　³H-TdR实验结果　(Fig 1).

图1　血小板源生长因子-AB对NsFb和HTsFb DNA合成的影响

　　fig 1　PDGF-AB effect on DNA synthesis of NsFb and HTsFb

　　2.2　细胞周期结果　(Fig 2).

图2　血小板源生长因子-AB对NsFb和HTsFb周期的影响

　　fig 2　PDGF-AB effect on cell cycle of NsFb and HTsFb

　　3　讨论

　　细胞周期是为研究细胞的生长行为而提出的，在体外培养条件下，细胞处于生长或静止状态，细胞生长包括DNA合成及细胞分裂两个关键过程，细胞周期即一个母细胞分裂结束后形成的细胞至其下一次再分裂结束形成两个子细胞的这段时期，可分为间期和分裂期两个阶段. 正常情况下，多数细胞处于间期，少数细胞处于分裂期，一般间期时间长，分裂期时间短. 在间期，细胞完成生长过程，主要为DNA的合成以及与细胞分裂有关的蛋白合成作准备，细胞间期又分为DNA合成前期（G₁期）、S期和DNA合成后期（G₂期），其中决定细胞周期长短的主要是G₁期的长短. 细胞分裂的过程受到多种因素的调控，经典的细胞生物学认为从G₁期到S期之间存在着决定细胞生长控制点,在该点有多种蛋白成分参与调控细胞的有丝分裂，这种蛋白成分统称为“U蛋白”^［3］. PDGF-AB作为一种重要的有丝分裂原可能也是通过此途径起作用.

　　³H-TdR参入结果表明PDGF-AB能显著增加HTsFb和NsFb DNA的合成，且均呈现剂量依赖性关系，但对HTsFb和NsFb作用有差异性，对NsFb, PDGF-AB浓度在50 μg/L左右时对DNA合成刺激作用最强，过高的浓度刺激作用反而下降，这可能与细胞内反馈系统的启动有关，如p53基因及其它抑制基因的启动和表达有关^［4］，对HTsFb而言，在PDGF-AB浓度在100 μg/L时对DNA的刺激作用达到最高峰. Warrenl Garner研究表明TGF β₁对正常肺组织来源的Fb比纤维化肺组织来源的Fb DNA合成的促进作用要强，认为这是因纤维化肺组织来源的Fb已经受到了各种因素的作用，主要表现为合成表型，而增殖分裂能力弱^［5］.

　　我们用流式细胞术测定了PDGF-AB对HTsFb和NsFb细胞周期的影响，结果表明：①正常状况下，HTsFb G₁期明显比NsFb长（74.5∶68.3）这与³H-TdR的结果相符合，解释了HTsFb比NsFb生长缓慢、细胞周期长的原因；②经PDGF-AB作用后，HTsFb，NsFb的细胞周期均发生明显变化，表现在G₁期细胞百分比减少，S+G₂+M期细胞的百分比增加，且呈明显剂量依赖性关系（Fig 1,2）,表明PDGF-AB能明显促进两种细胞的DNA合成及细胞分裂增殖；③PDGF-AB对HTsFb和NsFb的细胞周期作用存在着显著差异，表现在对HTsFb,S期细胞比例明显高于NsFb的S期比例，说明PDGF-AB对促进HTsFb向合成型表型转化的作用强,而对NsFb促进其向分裂增殖型表型转化的能力强.

　　总之，我们用³H-TdR参入及流式细胞仪测定了PDGF-AB对HTsFb和NsFb DNA合成与细胞周期的影响及差别，反映了PDGF-AB在创面愈合及疤痕增生性疾病中的作用，但PDGF-AB作为众多生长因子家族成员之一，其具体作用方式可能多种多样，有自分泌和旁分泌作用，亦有直接或间接的作用，即可以通过调节其它生长因子如TGFα,β和EGF等的分泌起作用^［6］，具体机制尚须进一步探讨.

　　作者简介:董茂龙，男，1971-10-31生，湖北省武穴市人，汉族，1995年第四军医大学医疗系毕业,硕士，已发表论文3篇. 导师陈　璧. 电话:(029)3375297作者单位：董茂龙　陈璧　贾赤宇　汤朝武(第四军医大学西京医院整形外科中心烧伤科陕西 西安 710033）

　　曹云新(第四军医大学中心实验室, 陕西 西安 710033）

　　参考文献

　　1 Deuel TF, Kawahara RS, Mutoe TA et al. Growth factors and wound healing: Platelet-Derived growth factor as a model cytokine. Annu Rev Med. 1991;42: 567-584

　　2 Russell R, Elaine WR,Daniel FB et al. The biology of platelet-derived growth factor. Cell,1986;46(5):155-169

　　3 Bruce A, Dennis B, Julian L. Cell growth and division. Mol Cell Bio, 1981:611-619

　　4 Harry NA, Theoofanis G, Jainine NG. P53 expression during normal tissue regeneration in response to acute cutaneous injury in swine. J Clin Invest,1994;93(5):2206-2214

　　5 Yusuf K, Alexis D, Jean-Clande P et al. Cytoskeletal protein modulation in pulmonary alveolar myofibroblasts during idiopathic pulmonary fibrosis. Am J Respir Crit Care Med, 1995;152(6-pt1):2163-2169

　　6 Pierce GF, Mustoe TA, Lingelbach J et al. PDGF and TGFβ enhance tissue repair activities by unique mechanisms. J Cell Biol,1989;109(1):429-440