β—淀粉样蛋白与早老素：阿尔茨海默病分子遗传学研究新进展

国外医学·老年医学分册 1998年5月 第19卷 第3期

中山医科大学附属一院神经科（510080） 马秋兰综述 钱采韵 刘焯霖审校

　　关键词 阿尔茨海默病；β—淀粉样蛋白；基因；早老素-1；早老素-2

　　阿尔茨海默病（AD）是中枢神经系统一种常见的退行性疾病，临床上主要表现为进行性记忆力减退、智力下降、伴有或不伴有轻度神经系统体征。AD的神经病理特征是：神经细胞内的神经纤维缠结；细胞外结构中的神经斑或称老年斑以及累及皮层动脉和小动脉的血管淀粉样变性。根据发病年龄和家族聚集性，AD可分为早发性、晚发性家族性AD（FAD）和散发性AD（ASD）。FAD属常染色体显性遗传，具有遗传异质性。目前已知与AD有关的基因有4个，分别位于第21、19、14和1号染色体上。2%～3%的早发性FAD由21号染色体上的β—淀粉样蛋白前体（APP）基因突变所致。19号染色体上的apoE₄基因是SAD发病的高危因子。最近研究发现，70%～80%的早发性FAD与14号染色体上的早老素-1（presenilin-1,PS-1）基因突变有关^[1]。也有报道占50%～60%。少部分FAD由1号染色体上的早老素-2（presenilin-2,PS-2）基因突变所致^[2]。40%～50%SAD与PS-1第8外显子3'端内含子多变态性有关^[3]。PS基因突变可能引起APP异常剪切和加工，产生过多的β—淀粉样蛋白（Aβ）。本文就Aβ新近相关研究和PS的分子结构、基因突变及可能的致病机理研究进展以予以综述。

　　1 Aβ

　　AD的重要病理特征之一是在患者脑实质内存在大量的老年斑和小动脉的血管淀粉样变性。研究证实，老年斑和血管淀粉样变性的核心物质Aβ由39～43个氨基酸组成，含40个氨基酸残基的Aβ主要在脑血管中沉淀；Aβ₄₂主要在老年斑中沉淀，并在AD发病机制中起关键作用。Aβ分子量约4.0～4.2KD，故有时写为Aβ₄。Aβ₄由APP水解产生。APP基因位于21号染色体，至少含有19个外显子和190千碱基对，可产生10个以上APP等位体。APPmRNA含量在AD患者脑神经元、脑基底核和蓝斑神经元中明显增高。4种APPmRNA编码695、714、751和770个氨基酸蛋白含有Aβ₄，Aβ₄在APP₆₉₅由外显子14和15的生，在APP₇₇₀则由外显子16和17产生^[4]。APP基因突变可比正常APP裂解更多的Aβ₄，但这种突变只占FAD的2%～3%，不具有普遍性。已发现的APP基因突变点有：APP₇₇₀的Val₇₁₇→Ile、Giy、Phe；APP₇₇₀的Lys_670、671出现基因双突变，即Lys_670、671→Asu₆₇₀、Leu₆₇₁。

　　Aβ₄可存在正常人和AD患者血液和脑脊液中^[5]，但细胞分泌Aβ₄后，Aβ₄在体液中以何种形式运输和代谢，目前尚不清楚。最近研究显示，生理情况下，约89%Aβ₄结合白蛋白而被运输；5%Aβ₄选择性地结合极低密度脂蛋白、低密度脂蛋白和高密度脂蛋白；少数Aβ₄游离于血浆中^[6]，故临床常规生化检验难以测定。Aβ₄在血浆中的分布不受apoE基因型影响。Aβ₄对神经元的毒性作用已被证实。在有PS-1、PS-2和APP基因突变的FAD患者血浆和培养的成纤维细胞中，Aβ₄₂₍₄₃₎浓度较对照组明显增高^[7]。另外，研究发现未剪切的APP自身也在AD的发病机制中起作用，APP可以激活MAP激酶，引起微管相关蛋白Tau异常磷酸化，形成神经纤维缠结。

　　2 PS-1

　　早在1992年Schellenberg等^[8-9]进行基因链锁分析发现，早发性FAD的一个相关基因位于第14号染色体上，并定位于D14q^[24，3]，当时称为AD3基因座，后被其它学者所证实。1995年Sherrington等学者首先用基因定位克隆技术确定了AD3的最小共分离区。然后用人工酵母染色体、P₁噬菌体和穿梭载体构建了重叠基因组DNA片段结构图，并以人脑mRNA为模板建立了100～600bp的独立cDNA片段。然后用Southern印迹杂交、交叉杂交和核苷酸测序等方法分离出19种不同的转录子作为候选基因。，最后通过比较病人与对照者之间这些候选基因的序列差异，找出了一个AD相关基因，当时被命名为S182基因^[10]。1995年6月，加拿大多伦多大学St.George—Hyslop等首先在“自然”杂志上将S182基因命名为PS-1基因。

　　2.1 PS-1的分子结构

　　PS-1基因转录产物约3.0kb,5'UTR富含GC区，其编码区由10个外显子组成^[11]。PS的确切分子结构尚不清楚，但从人和啮齿类cDNA的最长开放阅读框架（open reading frame,ORF）中推测，PS-1编码一个由467个氨基酸组成的蛋白质，PS-1的枯扑学研究表明它是一个整合膜蛋白，如膜受体，通道蛋白或结构蛋白。N’—末端含有VRSQ氨基酸序列，而缺乏信号肽和糖化部位。PS-1至少含有7个疏水跨膜结构区（transmembrane,TM）和6个连接TM的亲水环（hydrophilic loop,HL），其中连接第6跨膜区（TM₆）和第7跨膜区（TM7）的第6亲水环（HL-6）比较长。PS-1的mRNA在人类和大鼠的多种组织中表达。在中枢神经系统，主要在海马和小脑组织中表达^[12]。PS-1主要分布在神经元内质网和高尔基体中^[13]。

　　2.2 PS-1基因突变

　　Sherrington等用RT-PCR方法研究了7个早发性FAD家系中每个患病成员的PS-1基因，发现在6个早发性FAD家系中共有5种形式的错义突变，分别发生在146Met→Leu ,163His→Arg，246Ala→Glu,286Leu→Val和410Cys→Tyr,146处Met还可被Val、Ile替代^[14]。这些突变都发生在 pS-1的高度保守结构域中。而在家系中非患病成员和140多名正常对照者中均未发现突变。这些结果表明， pS-1基因突变是导致FAD发病的基因因素。目前，在不同种族的40多个家系中已发现PS-1基因的20多个不同突变^[15～18]。这些突变主要集中在PS-1的5个跨膜区和3个亲水环上，其中以发生在TM2（30%）和HL-6（37.5%）上为最多。这两个区域分别由外显子5和外显子8编码。PS-1的10个外显子中已发现有6个存在突变。其中65%的突变发生在第5和8外显子上。另外,Hutton等^[19]的研究发现，PS-1基因还存在另一种突变－剪切位点突变。在早发性FAD的PS-1基因外显子9的3'端内含子在存在G→T改变。这一突变导致了剪切位点的破坏，产生了不含外显子9的PS-1mRNA。由于外显子9编码的是TM6与TM7之间的HL-6，该基因的突变导致了HL-6短于正常PS-1。但并不影响mRNA的ORF。由于外显子9编码的HL-6位于胞浆侧，因此，该剪切位点的改变并不影响跨膜结构，也有会改变PS-1的拓扑结构。但外显子9可能与PS-1的异常生理功能有关。

　　2.3 PS-1遗传多态性

　　apoE的遗传多态性与SAD有关，但不能解释全部SAD。最近研究表明，SP-1内含子的多态性也与SAD有关。在SP-1第8外显子的3'端的内含子上，存在遗传多态性，即等位基因1（16位核苷酸为A）。与等位基因2（16位核苷酸为C）Wragg等^[20]通过对208例美国白人SAD和185例年龄匹配的正常对照者的研究发现，等位基因11纯合子携带者发生FAD的危险性明显增加，11基因型的特异危险度为0.22。这一结果已被英国和日本的研究证实^[21]。与apoE_[4]相似，PS-1内含子11基因型可能是SAD发病的另一个独立危险因素。

　　3 PS-2

　　1995年，St George-Hyslop和Sherrington等学者分别发现了位于第1号染色体1q^31-42上的另一个AD相关基因PS-2，当时被分别命名为E5-1和STM2基因。PS-2含448个氨基酸残基，其拓扑结构与PS-1十分相似，也含7个疏水跨膜区，与PS-1具有67%的同源性，而在跨膜区序列84%与PS-1相同^[22]。PS-2N'-末端约80多个氨基酸残基序列与PS-1区别较大，连接TM6与TM7之间的亲水环（HL6）比PS-1短24个氨基酸残基。PS-2基因突变发生率较低。目前仅在8个家系中发现2个错义突变，分别位于141号密码子（Asn→Ile）和239号密码子（Met→Val）。第141号密码子突变形成一个紧邻跨膜区的从亲水的门冬酰胺到疏水的异亮氨酸的改变，此突变可能不利于蛋白质在膜上镶嵌或固定。目前，PS-2蛋白的的正常细胞功能尚不清楚，某些学者认为，PS-2基因表达程度与AD病程进展有关。Vito最近报道了一种与PS-2同源的基因-AGL-3，基作用为挽救来自T细胞受体的T细胞杂合体和Fas引起的凋亡^[23]。实验表明，变异的PS-2基因可引起细胞凋亡，而在培养的神经细胞中，正常的PS-2基因无此作用^[24]。如果PS-2也具有AGL-3的功能，则变异的PS-2在AD脑中可能具有引起细胞凋亡的作用，就可导致AD脑中神经细胞的丧失，与PS-2基因表达减少相一致，符合AD的病理特征改变。推测PS-2基因点突变也发生在保守结构域内。

　　Northern印迹分析发现，PS-2的mRNA在人类多种组织中表达。PS-2mRNA的转录本有两个，分别为2.4kb和2.8kb。2.8kb的转录本主要在胎盘、骨骼肌和心脏中表达。2.4kb的转录本主要在心脏、脑、胎盘和骨骼肌中表达。PS-2基因表达定量分析发现，在AD患者脑中，PS-2在前脑基底节、额叶皮层和海巴区表达较对照组明显减少^[25]。研究证实，PS主要存在细胞的内质网和高尔基器中，而内质网和高尔基是蛋白加工和运输的中心。故可推测，PS基因变异可引起APP蛋白的加工和运输异常，产生过多的Aβ而形成老年斑。

　　4 PS的生理功能和可能的致病机理

　　PS的确切分子结构和生理功能尚不清楚，但许多研究表明，PS-1和来自Caenorhbabditis elegans线虫的spe4为同源结构蛋白。故可从其同源结构蛋白中推测SP的功能。spe4是一种膜蛋白，参与精子生成过程中纤维体-膜细胞器的形成，并参与可溶性和膜结合蛋白的运输和储存。spe4基因突变，导致了在精子发生过程中某些蛋白在细胞中分隔空间之间的传递障碍，而阻碍了精子形成。由此可推测，PS蛋白可能和一些蛋白在细胞内的传递有关。PS基因的突变可导致APP的异常转运和加工，产生过多的Aβ₄蛋白。Martins等从一名带有Ala→Glu246基因突变的FAD患者身上采集活检皮肤成纤维细胞标本，对成纤维细胞进行培养，发现在其中一株成纤维细胞的培养基中Aβ₄的水平明显高于对照组，表明具有PS基因突变的细胞株在一定条件下产生过多的Aβ₄或Aβ₄的清除受阻。Scheaner等学者的研究结果也证实了携带PS基因突变的AD患者成纤维细胞、血浆中及突变PS转基因鼠、转染细胞中Aβ_1-42/Aβ_1-40比率明显增高^[27-28]。目前认为，Aβ₄₂在SAD和FAD中起重要的致病作用，Aβ₄₂沉淀快，毒性大，经常见于老年斑中，但生理情况下极少见。研究结果表明，APP蛋白裂解与PS基因突变间存在的着直接关系。另有研究认为，对于SAD，PS-1表达的改变与Aβ₄的沉积无关，而与神经纤维缠结的形成有关，即引起细胞骨架蛋白之间的相互作用异常（如微管相关蛋白tau）而影响细胞的命运^[29]。细胞内蛋白异常可进一步影响以细胞外Aβ蛋白沉淀，最终导致AD。Bouras等^[30]采用免疫组化及双重染色技术发现在含有神经纤维缠结的神经元中，PS-1的表达明日减少。提示PS-1的缺乏可能与神经退化的易感性增加有关。

　　尚有证据显示，PS-1与Caenorbabditis elegans线虫的sel-12基因在结构上有50%相同，并发现80%PS-1突变的密码子在sel-12中保留。sel-12基因编码多种跨膜结构域蛋白，具有促进由lin-12(一种跨膜受体蛋白)介导的从细胞表面到细胞核的信号传导功能^[31]。目前，sel-12参与信号传导的确切机理尚不清楚，PS-1是否也具有参与信号传导的功能尚待证实。但最近研究表明，PS-1蛋白具有进化调节通道的作用，如Notch通道，即一种蛋白，其作用为传递决定细胞命运的信号-使细胞进化为神经细胞还是肌细胞。PS如何产生Notch信号传导功能的机理尚不清楚，许多学者认为，PS蛋白可能在细胞内蛋白处理系统中起作用，帮助Notch到细胞膜外的正常位置。如果推测正确，则变异的PS改变了细胞处理蛋白方式一导致APP异常剪切，产生过多的Aβ₄蛋白。PS-1还与一种电压依赖性钙离子通道的α-1D亚基有弱的同源性，而且PS-1基因突变点在MT2（A螺旋结构）编码区上的排列呈特殊形式，提示PS可能为一种离子通道。有实验证实，AD患者存在离子通道功能异常，如对四氯乙胺敏感的113PS钾离子通道异常和钙离子自稳态紊乱^[32]。在FAD，PS的基因突变引起了通道的微孔结构的破坏，各亚基之间相互作用障碍，从而影响了细胞膜内外钙离子的交换。应用钙影像技术也发现，钙离了子在AD患者成纤维细胞、淋巴细胞、单核细胞、血小板内均增加。而tau蛋白过度磷酸化和Aβ₄蛋白的增加均与细胞内钙离子的增加有关。

　　5 临床特点

　　近年来研究资料表示，FAD具有遗传异质性，其临床表现型也具有异质性。Kennedy等认为携带APP基因突变的AD患者发病年龄较早，主要临床特征是早期出现肌阵挛、癫痫、抑郁、缺乏自知力及伴有轻度的近记忆力减退；随后出现人格改变、视空间障碍；晚期可有言语障碍及严重记忆力的障碍。癫痫发作不伴有脑电图异常。PET显示双侧颞顶叶低代谢^[33]。与具有APP基因突变的AD患者相比，携带PS-1基因突变的AD患者发病年龄较早，而PS-2基因突变的患者发病年龄相对较晚；临床特征早期以记忆力减退、言语障碍、人格改变及左侧脑半球易患性增高为主，可有肌阵挛和癫痫。部分病例脑脊液中发现有寡克隆带，但无脱髓鞘病及淀粉样血管病的病理证据。PET检查左侧顶叶、上边缘回代谢降低比右侧明显^[34]。在SAD早期以记忆力减退为主，少数晚期病情严重时出现肌阵挛和阗痫发作。SAD的PET改变也为双侧颞叶低代谢。由此可见，不同的AD基因型可能反映了不同的临床表现型，而同一基因型的家系，其临床表现基本相同。

　　6 小结

　　早老素基因突变是大多数FAD的主要病因，但并非唯一病因。PS基因的发现为AD发病机制的研究提供了新的途径。进一步明确正常和异常PS的分子结构、生理功能、PS与apoE、APP尤其与Aβ之间的相互关系及用突变的PS基因制造出接近AD病理改变的动物模型将对今后研究起重要影响。

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校对时间：99-12-08　16:35　杜育苗