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细胞因子对骨髓增生异常综合征造血前体细胞凋亡的影响及其临床意义
中华血液学杂志 1998年第1期第19卷 论 著
作者：操州虹 李蓉生 李琦
单位：100730 中国医学科学院、中国协和医科大学北京协和医院
关键词： 红细胞生成素；粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子；白细胞介素3；骨髓增生异常综合征；造血干细胞；细胞凋亡
摘要 目的：探讨造血细胞生长因子对骨髓增生异常综合征(MDS)造血细胞凋亡的影响，为临床应用提供理论依据。方法：采用吸附单克隆抗体的免疫磁珠分离系统分离纯化12例MDS患者骨髓CD34+细胞，采用碘化丙锭染色、流式细胞仪分析和细胞核形态检测两种方法同时检测体外培养的MDS造血前体细胞增殖、分化过程中的凋亡状况；观察rhEpo、rhIL-3及rhGM-CSF对它们的影响，并进行了定量分析。结果和结论：发现大剂量的rhEpo可抑制体外培养的MDS造血前体细胞凋亡。在培养的第7，10，14天，大剂量rhEpo组(Epo200U/ml、100U/ml组)细胞凋亡程度较小剂量rhEpo组(20U/ml、2U/ml、0.2U/ml组)显著减轻，且与rhEpo呈量效关系。rhGM-CSF、rhIL-3也可抑制体外培养的MDS造血前体细胞凋亡，rhIL-3 100U/ml组与50U/ml组、rhGM-CSF 500U/ml组与50U/ml组差异显著，与大剂量rhEpo(100U/ml)联用时可产生协同作用，显著地抑制造血前体细胞的凋亡。
The role of hematopoietic growth factors on extensive apoptosis of myelodysplastic hematopoietic cells and its clinical significance Cao Zhouhong,Li Rongsheng,Li Qi.Peking Union Medical College Hospital,PUMC and CAMS,Beijing 100730
Abstract Objective:To investigate the effects of hematopoietic growth factors (HGFs) on apoptosis of hematopoietic cells in myelodysplastic syndromes (MDS) patients.Methods:CD34＋ cells in bone marrow from 12 MDS patients were purified by an immunomagnetic beads sorting system.Apoptosis of hematopoietic precursors was assayed by propidium iodine staining and flow cytometric analysis.Results and Conclusion:High dose rhEpo partly suppressed apoptosis of hematopoietic cells in MDS patients.At the 7th,10th,14th,cultured day,the apoptotic percentages of the high dose Epo group (rhEpo 200U/ml or 100U/ml) were substantially lower than that of the low dose group (20
U/ml,2U/ml and 0.2U/ml) and showed a dose-dependent effect with rhEpo.rhGM-CSF and rhIL-3 could also suppress hematopoietic cell apoptosis in vitro,the differences between the high dose group (rhIL-3 200U/ml or rhGM-CSF 500U/ml) and the low dose group (rhIL-3 50U/ml or rhGM-CSF 50U/ml)were significant.Extensive apoptosis of myelodysplastic hematopoietic cells were markely suppressed when rhEpo and rhIL-3 or rhEpo and rhGM-CSF were given together.
Key words Erythropoietin Granulocyte-macrophage colony stimulating factor Interleukin-3 Myelodysplastic syndromes Hemopoietic stem cell Apoptosis
骨髓增生异常综合征(MDS)是累及多能造血干细胞的克隆性疾病，MDS患者骨髓造血前体细胞在分化发育过程中发生过度凋亡，导致外周血一系、二系或三系血细胞减少，并出现骨髓三系造血前体细胞明显的病态造血。近来研究发现，MDS患者体内一些为细胞生存所必需的造血细胞生长因子水平存在异常，如干细胞因子(SCF)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)水平明显低于正常对照组，血清红细胞生成素(Epo)水平却高于正常对照组［1］。这些均可能与MDS骨髓造血前体细胞在分化发育过程中发生过度凋亡有关。为探讨临床上应用白细胞介素3(IL-3)、Epo、粒-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、G-CSF治疗MDS患者的作用机制，我们观察了rhEpo、rhIL-3、rhGM-CSF对体外培养的MDS造血前体细胞凋亡状况的影响，并进行了定量分析，以图为临床应用这些造血细胞生长因子提供一些依据。
材料和方法
1 病例选择 MDS患者12例，按FAB分型，RA 6例、RAS 1例、RAEB 4例，RAEB-t 1例。其中男性7例，女性5例，年龄18～70岁，均系我院门诊及住院患者，按文献［2］确诊。
标本采集：自髂前或髂后上棘抽取骨髓10ml，注入盛有IMDM培养基(含0.1%肝素)的无菌瓶中备用。标本在采集后2小时内完成造血干细胞的分离。
对照组为本院胸外科非肿瘤及非血液系统疾病患者手术切除的肋骨，用无菌咬骨钳挤出骨髓液，其余处理同前。
2 造血前体细胞(CD34+细胞)的分离及体外培养 用淋巴细胞分离液(d＝1.077)密度梯度离心分离出骨髓单个核细胞，PBS洗2次，用德国Miltenyi Biotec公司的吸附单克隆抗体的免疫磁珠(MACS)分离系统分离，分离的细胞经流式细胞仪鉴定其纯度(在90%以上)后加入24孔板，每孔细胞数1×105/ml，37℃、5%CO2、100%湿度培养14天。培养体系：IMDM培养基中含有20%胎牛血清、1%牛血清白蛋白、1×10－5mmol/L二巯基乙醇、10μg/ml胰岛素、0.4%左旋谷氨酰胺、2U/ml rhEpo(日本Kirin公司)、50U/ml rhIL-3(日本Kirin公司)、50U/ml rhGM-CSF(美国Schering-Plough公司)、50U/ml rhG-CSF(日本Kirin公司)、100U/ml青霉素、100mg/ml链霉素。分别于培养第1天至14天收集细胞，0.05%台盼蓝染色，计数不着色细胞，计算存活细胞百分率。
3 rhEpo对体外培养的MDS骨髓造血前体细胞凋亡的影响 分为Epo 200,100,20,2,0.2U/ml 5组，分别在培养的第7，10，14天收集细胞，碘化丙锭(PI)染色，流式细胞仪分析凋亡细胞百分率。
4 rhIL-3对体外培养的MDS造血前体细胞凋亡的影响 分为rhIL-3 50,100U/ml 2组，在培养的第7，10，14天收集细胞，PI染色，流式细胞仪检测，分析凋亡细胞百分率。
5 rhGM-CSF对体外培养的MDS造血前体细胞凋亡的影响 分为rhGM-CSF 50,500U/ml 2组，在培养的第7，10，14天收集细胞，PI染色，流式细胞仪检测，分析凋亡细胞百分率。
6 体外培养的造血前体细胞凋亡的检测
6.1 细胞核形态观察：于培养的第7，14天收集细胞，PBS洗2次，加入DNA荧光染料Hoechst 33342(Sigma公司)至终浓度10μmol/L，37℃染色15分钟，重新悬浮于含血清培养基中，滴片，荧光显微镜下观察细胞核DNA荧光。
6.2 PI染色，流式细胞仪计数：细胞于4℃，70%乙醇固定24小时，PBS洗3次，加入50μg/ml RNA A酶37℃孵育30分钟，50μg/ml PI 4℃染色1小时，用流式细胞仪进行细胞周期分析，计算各期及凋亡细胞百分率。为排除坏死细胞干扰，样品固定前取少量细胞进行PI及Hoechst 33342染色，PI阴性率控制在90%以上。
7 统计学处理 采用t检验、配对t检验。
结 果
1 rhEpo对体外培养的MDS造血前体细胞凋亡的影响 大剂量rhEpo可抑制体外培养的MDS造血前体细胞凋亡。培养的第7，10，14天，大剂量rhEpo组(200，100U/ml)细胞凋亡程度较小剂量rhEpo组(20，2，0.2U/ml)显著减轻，且与rhEpo呈量效关系。培养的第7，10天rhEpo200U/ml组与100U/ml组细胞凋亡百分率差异显著(附图，表1)。
附图 rhEpo对MDS骨髓造血前体细胞凋亡的影响
表1 不同浓度rhEpo对体外培养不同时间的MDS造血前体细胞凋亡的影响(%)
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Epo浓度(U/ml) |
第7天凋亡率(%) |
第10天凋亡率(%) |
第14天凋亡率(%) |
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200.0 |
23.43±2.24＃ |
25.86±6.69＃ |
34.46±9.59＃ |
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100.0 |
29.13±3.10△＃ |
34.85±6.07△＃ |
37.99±10.07＃ |
|
20.0 |
36.78±6.68△ |
41.67±5.22△ |
47.23±4.02△ |
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2.0 |
37.70±2.16△ |
44.87±9.69△ |
50.44±7.17△ |
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0.2 |
40.98±4.42△ |
49.85±1.86△ |
52.42±6.60△ |
△与rhEpo 200U/ml相比较，P值＜0.01；＃与rhEpo 2U/ml相比较，P值＜0.012 rhIL-3对体外培养的MDS骨髓造血前体细胞凋亡的影响 rhIL-3 100U/ml组细胞凋亡较50U/ml组显著减少，与100U/ml Epo联用可产生协同作用，显著抑制造血前体细胞凋亡，组间差异显著(见表2)。
表2 rhIL-3对MDS骨髓造血前体细胞凋亡的影响( ±s)
| 组 别 |
例数 |
第10天凋亡率(%) |
| A＋C组 |
12 |
44.87±9.69＃ |
| B＋C组 |
12 |
26.59±4.80＃△ |
| A＋D组 |
12 |
34.85±6.07＃ |
| B＋D组 |
12 |
18.09±5.99 |
A为rhIL-3 50U/ml；B为rhIL-3 100U/ml；C为rhEpo 2U/ml；D为rhEpo 100U/ml；＃与B＋D组相比较，P值
＜0.01；△与A＋C组相比较，P值＜0.013 rhGM-CSF对体外培养的MDS骨髓造血前体细胞的影响 rhGM-CSF 500U/ml组较50U/ml组凋亡显著减少，与大剂量Epo(100U/ml)联用可产生协同作用，组间差异显著(见表3)。
表3 rhGM-CSF对MDS骨髓造血前体细胞凋亡的影响(±s)
| 组 别 |
例数 |
第10天凋亡率(%) |
| E＋C组 |
11 |
37.99±10.07＃ |
| F＋C组 |
11 |
28.94±10.86＃△ |
| E＋D组 |
11 |
34.85±6.07＃ |
| F＋D组 |
11 |
21.22±2.54 |
E为rhGM-CSF 50U/ml；F为rhGM-CSF 500U/ml；C、D含义同表2；＃与F＋D组相比较，P值＜0.01；△与E＋C组相比较，P值＜0.05
讨 论
骨髓增生异常综合征(MDS)是发生在多能造血干细胞阶段的异质性克隆性疾病，MDS造血干细胞在分化发育过程中存在分化功能的缺陷和过度凋亡现象。许多研究表明，MDS患者造血干、祖细胞生长延迟，对G-CSF、GM-CSF、IL-3、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)反应降低［3］。对过饱和的外源性生长因子(G-CSF、GM-CSF、IL-3、Epo、M-CSF)才有一定的反应［4］。MDS造血干、祖细胞对外源性生长因子低反应的原因可能是：①MDS造血干、祖细胞在细胞成熟和分化过程中，成熟细胞过度凋亡，干、祖细胞分化延迟、停止或分化后凋亡；②MDS骨髓细胞上的生长因子受体数目减低，受体结合力减低或信号传导异常［4］。Miyajima等［5］的研究表明Epo、GM-CSF、IL-3促进造血细胞生长的机制为促进DNA复制和抑制细胞凋亡。因此，可以用大剂量生长因子治疗MDS患者，减少骨髓造血前体细胞在分化发育过程中发生过度凋亡，抑制MDS患者骨髓的无效造血。
Epo、GM-CSF、IL-3是维持造血前体细胞增殖、分化和存活的重要因子。文献报道，Epo可阻止骨髓红系前体细胞(CFU-E、部分BFU-E)在分化、发育过程中凋亡［6］。本实验中大剂量的rhEpo(200U/ml、100U/ml)对体外培养的MDS骨髓造血前体细胞的凋亡有显著的抑制作用，与临床上应用大剂量rhEpo治疗MDS患者部分有效相符合。但大剂量rhEpo(200U/ml)并不能完全纠正MDS造血前体细胞的过度调亡，其原因可能是MDS的病因、发病机制复杂，除过度凋亡之外，还存在其他机制；MDS患者造血干细胞缺陷发生在BFU-E或以上水平，对Epo反应差或无反应［6，7］。
IL-3、GM-CSF是髓系前体细胞增殖、存活和分化发育为成熟中性粒细胞、嗜酸粒细胞、单核细胞等所必需的因子，可显著抑制依赖IL-3、GM-CSF细胞株的凋亡［8］。近来研究发现，IL-3＋Epo、GM-CSF＋Epo对于BFU-E细胞的增殖、分化具有协同作用［8］。本实验中，IL-3100U/ml、GM-CSF 500U/ml可显著抑制MDS骨髓造血前体细胞的凋亡，联合应用组(rhIL-3 100U/ml＋rhEpo 100U/ml)MDS造血前体细胞凋亡程度较单用rhIL-3及rhEpo组显著减轻，rhGM-CSF 500U/ml＋rhEpo 100U/ml组较单用rhGM-CSF、rhEpo组对MDS造血前体细胞的凋亡抑制更为明显；集落培养显示不仅细胞数量增加而且集落体积也明显增大，提示临床上在应用大剂量Epo治疗MDS患者的同时，可以联合应用rhIL-3或rhGM-CSF以增强疗效。
近来有文献报道IL-3、GM-CSF可促进MDS恶性克隆细胞的增殖而加速其向白血病转化［9］，本研究由于RAEB、RAEB-t病例较少(5例)尚未发现此种现象。
志谢：本实验在利用流式细胞仪检测和分析过程中得到北京医科大学附属人民医院陈珊珊教授、高晖医师和中医研究院庞大本教授、池旭生教授及本院检验科王美健医师的大力帮助，在此表示感谢
参 考 文 献
1 Verhoef GE,Schouwer P,Ceuppens L,et al.Measurement of serum cytokine levels in patients with myelodysplastic syndromes.Leukemia,1992,6:1268-1272.
2 杨崇礼.骨髓增生异常综合征(MDS).见：张之南主编.血液病诊断及疗效标准.天津：天津科学技术出版社，1991.225-231.
3 Merchav S,Wagemarker G,Souro LM,et al.Impaired response of myelodysplastic marrow progenitors to stimulation with recombinant hematopoietic growth factors.Leukemia,1991,5:340-346.
4 Sawada K,Sato N,Tarumi T,et al.Proliferation and differentiation of myelodysplastic CD34+ cell in serum free medium response to individual colony-stimulating factors.Br J Haematol,1993,83:349-358.
5 Miyajima A,Kinoshita T,Waka OH,et al.Signal transduction by the hematopoietic cytokine receptors.Inter J Hematol,1996,64(Suppl):17.
6 Merchav S,Nielseno J,Rosen BH,et al.In vitro studies of Epo-dependent regulation of erythropoiesis in MDS.Leukemia,1990,4:771-780.
7 Aoki H,Homoci M,Higashi K,et al.Responsiveness of bone marrow erythropoietic stem cells(CFU-E and BFU-E) to rhEpo in vitro in AA and MDS.Am J Hematol,1990,35:6-12.
8 Saeland S,Caux C,Favre JP,et al.Effects of recombinant human interleukin-3 on CD34+-enriched normal hematopoietic progenitors and on myeloblastic leukemia cells.Blood,1988,72:1580-1588.
9 Brodky RA,Bedi A,Jones RJ.Are growth factors leukemogenic?Leukemia,1996,10:175-177.
(收稿：1996-11-04 修回：1997-08-04)
(校对：张志方)
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